Prime Editing “破局”

Prime Editing，即引导编辑，是一项基于“搜索和替换”（search-and-replace）的基因组编辑方式。引导编辑由Broad研究所的David Liu实验室开发，于2019年最早发表在nature杂志上。Prime Editing的过程为：首先，将经过改造的向导RNA（pegRNA）与prime editor蛋白相结合，pegRNA具有双重功能，既能够将编辑蛋白引导到目标位点，又含有编辑的模板序列。prime editor蛋白则由Cas9切口酶和逆转录酶融合而成。在Cas9切割目标位点之后，逆转录酶以pegRNA作为模板进行逆转录，然后将DNA直接聚合到切口的DNA链上。

引导编辑一经问世就引起了广泛关注，因为绝大多数的致病遗传变异都是碱基点突变及插入缺失突变，这也就意味着引导编辑在临床基因治疗中具有极大潜力。但目前引导编辑的编辑效率仍然较低，且暂时未能明确编辑效率的影响因素，此项技术尚处于起步阶段，其应用仍然受到极大限制。此前有针对pegRNAs的研究，发现pegRNAs的一种系统性改造能够有效提高引导编辑的编辑效率，但引导编辑技术仍然存在很大的提升空间，大有可为。

日前，美国哈佛大学David Liu实验室与普林斯顿大学Britt Adamso实验室合作研究发表在了Cell杂志上，论文题目为Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes

作者利用利用汇集的CRISPRi筛选，发现DNA错配修复(MMR)阻碍了启动子编辑，并促进了副产物产生，因此研究人员推断，抑制DNA错配修复通路，很有可能会对prime editing的编辑效率和准确性有提高作用。研究者还对prime editing系统融合蛋白进行了优化，并证实这种整体结构的优化可以进一步提高prime editing的编辑效果。

在本研究中，作者把CRISPRi筛选和PE系统有机结合，采用全新筛选策略Repair-seq，系统性分析了影响prime editing编辑效果的内源性因子，最终筛选出抑制DNA错配修复通路的几个关键因子，包括PMS2，MSH2，MSH6，MLH1。这几种因子都可以有效提升prime editing的编辑效率。研究者发现，共转MLH1的ATP酶失活型突变体E34A或内切核酸酶失活型突变体可以有效增强PE系统的基因编辑效率。研究者将PE2与MLH1 dn的组合称为PE4，将PE3与MLH1 dn的组合称为PE5。新的系统能够瞬时表达抑制 DNA 错配修复的蛋白，以提高编辑效率。分析表明，与早期的先导编辑系统相比，新系统的编辑效率要高出 2.0 到 7.7 倍。

研究人员还通过对系统中nCas9-MMLV融合蛋白的结构进行优化，进一步提高了prime editing的编辑效率。研究者将PEmax与改造后的pegRNAs（epegRNAs）以及MLH1 dn合用，发现这种组合方式可以最为显著的提高prime editing的效率和准确度。

本研究成功筛选出了对prime editing编辑效果产生影响的内源性因子，并据此开发出了提高prime editing编辑效率的新方向，取得了令人振奋的成绩。本研究最终开发出的PE升级版本PE4/PE4max以及PE5/PE5max为疾病的基因治疗提供了更加强大的工具。